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山東深析生物科技有限公司
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酶標儀,多的是你不知道的事

  • 分類:行業資訊
  • 作者:
  • 來源:
  • 發布時間:2020-02-04
  • 訪問量:0

【概要描述】酶標儀可以用來做什么?

測酶活,測細胞或者ELISA ?

或許,它還可以做一些更高級的東西。

比如,

利用FRET檢測轉錄因子引起的DNA彎曲,

甚至在線模擬

蛋白質與DNA的結合、解離速率。

讓我們一起看看

Thermo Scientific Varioskan LUX

如何利用FRET測量DNA彎曲

以及蛋白質與DNA的相互作用

酶標儀,多的是你不知道的事

【概要描述】酶標儀可以用來做什么?

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蛋白質與DNA的結合、解離速率。

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Thermo Scientific Varioskan LUX

如何利用FRET測量DNA彎曲

以及蛋白質與DNA的相互作用

  • 分類:行業資訊
  • 作者:
  • 來源:
  • 發布時間:2020-02-04
  • 訪問量:0
詳情

酶標儀可以用來做什么?

測酶活,測細胞或者ELISA ?

或許,它還可以做一些更高級的東西。

比如,

利用FRET檢測轉錄因子引起的DNA彎曲,

甚至在線模擬

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Thermo Scientific Varioskan LUX

如何利用FRET測量DNA彎曲

以及蛋白質與DNA的相互作用

Thermo Scientific Varioskan LUX Multimode Microplate Reader


引 言

SRY-related box(簡稱SOX)是一類存在于人類基因組中的轉錄因子,它們特異性地與CATTGTC樣的基因序列結合,調控多種發育相關基因的表達。SOX蛋白包含一個高遷移率族(HMG)DNA結合結構域,這個結構域可以與DNA雙鏈的小溝相互作用,使DNA鏈發生彎曲。研究表明,SOX 轉錄因子與DNA的結合可能使染色質結構發生改變,進而啟動細胞類型特異性的調控復合物或增強子的裝配,所以精確的彎曲拓撲結構和結合、解離速率是SOX 轉錄因子進行基因調控的關鍵。本研究利用純化的SOX18  HMG蛋白與同源SOX Prox1 DNA片段進行熒光共振能量轉移(FRET)試驗,分析了SOX蛋白與DNA相互作用中的DNA彎曲及蛋白質-DNA結合動力學。
材料與方法
? Varioskan LUX多功能酶標儀

? 重組SOX18 HMG 蛋白

? 偶聯熒光基團的15 bp Prox1基因調控序列,以不偶聯熒光基團的DNA序列作為對照。

彎曲試驗

退火合成三組雙鏈DNA,DO組只含有cy3供體熒光基團,AO組只含有cy5受體熒光基團,DL組為cy3和cy5雙熒光標記的DNA雙鏈。然后將DNA樣品分為2份,一份加入重組蛋白,另外一份不加,混合在1x FRET緩沖液中(如圖1A)。

按圖1B制備樣品,其中DNA濃度為60 nM,SOX18 HMG 蛋白濃度為500 nM,放入Varioskan LUX進行檢測。

圖片圖1  FRET實驗示意圖
注:(A) 反應液的準備與分組;(B) DNA片段和SOX18 HMG蛋白,樣品板制備,吸收光譜與發射光譜原理圖;(C) SOX18 HMS 結合前后DNA 5‘端熒光基團距離的變化。
FRET光譜設置圖片
a. 供體激發掃描:激發光波長535 nm,掃描555-720 nm間的發射光,包含~570 nm的供體發射光和~668 nm的受體發射光。

b. 受體激發掃描:激發光波長635 nm,掃描655-720 nm間的發射光,帶寬設置為5,測量時間設為10-1000 ms。
FRET動力學檢測
進樣器清洗:依次用75%乙醇,dd H2O,蛋白儲存緩沖液清洗酶標儀進樣器,上樣前打掉管路中所有液體,確保進樣器充滿上樣溶液。

反應體系:5x FRET緩沖液6 mL,DNA探針終濃度50 nM,根據加入的蛋白溶液體積將反應體系用ddH2O補足30 mL。

圖片放置樣品板,把蛋白溶液加入到進樣器中,在Varioskan LUX軟件中選擇樣品板類型及布局,如下圖設置檢測方案。


結果與討論
當SOX HMG box與DNA結合時,DNA片段兩側的5‘末端間的距離會由于彎曲而發生改變(圖1C)。因此,如果將兩個能發生熒光共振能量轉移的熒光基團偶聯到DNA的5‘末端,那么當DNA發生彎曲時,就可以觀察到熒光共振能量轉移現象。

圖2  FRET光譜和時間分辨結合試驗
注:(A) SOX18 HMG蛋白與雙鏈DNA結合前后的光譜圖。綠色曲線代表與蛋白結合前的純DNA樣品,藍色曲線代表與SOX18 HMG蛋白結合后的DNA樣品。AO代表僅含受體熒光基團的對照樣品,DO代表僅含供體熒光基團的對照樣品,DL代表雙熒光標記的Prox1雙鏈DNA。(B) 時間分辨性地測量SOX18 HMG蛋白與Prox1 DNA結合的FRET效應。


圖2 A可以看出:

? 與未結合蛋白的DNA相比,SOX18 HMG box與15 bp Prox1 DNA片段結合時,供體發射光明顯減少,受體發射光增加。

? 用cy3和cy5熒光基團單獨標記DNA片段,結果顯示SOX18 HMG并沒有使熒光發生明顯的猝滅或增強,說明所觀察到的光譜變化是真實的FRET效應,可以準確估計DNA實際的彎曲角度。

圖2 B可以看出:

? 用Varioskan LUX可以很好地測定SOX18 HMG與Prox1 DNA的快速結合。通過優化設置,動態測量的死時間可以控制在20 ms內,能夠準確模擬蛋白質與DNA相互作用時的結合、解離速率。
總 結
? Varioskan LUX非常適合用于FRET法研究DNA與轉錄因子的相互作用,可以準確評估DNA的彎曲角度及蛋白質與DNA的結合、解離速率;

? Varioskan LUX特有的帶寬可調功能,使得激發和發射波長最小間隔低至18nm;

? 本實驗中描述的FRET實驗可以用于研究其他的轉錄因子,RNA結合蛋白,從DNA到核小體的組裝,也可以用于高通量篩選SOX 轉錄因子與DNA相互作用的抑制劑。

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發布時間:2021-08-24 22:33:59

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